人结肠癌细胞LoVo/5-Fu耐药细胞株（LoVo/5-Fu） 一、细胞特性 （1）来源：结直肠腺癌 （2）形态：上皮细胞样，贴壁生长 （3）含量：>1×106 个/mL （4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性 （5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装 二、运输和保存 可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式： （1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏； （2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。 注：收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。 三、细胞用途 仅供科研使用。 四、细胞接收后的处理 （1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。 （2）在显微镜下确认细胞生长状态时，请在低倍镜（4或5×物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10×和20×物镜下，同时给细胞拍照各2-3张（10×，20×都要拍照），作为售后的依据。 （3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。 （4）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。 （5）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。 注意：①运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。②收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。 五、细胞培养步骤 1、细胞培养条件及相关试剂的配制 （1）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。 （2）完全培养基的配制： ①准备F12K完全培养基：北美胎牛血清，10%；双抗，1%；补充F12K基础培养基至所需体积。 ②准备F12K含5-Fu完全培养基：北美胎牛血清，10%；双抗，1%；5-Fu：400~1065uM；补充F12K基础培养基至所需体积。 （3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。 2、细胞培养 （1）细胞复苏 ①将恒温水浴锅中的水预热到37℃； ②准备一支15ml离心管，加入5mL含10%FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热； ③戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率； ④将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min； ⑤准备一个T25培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入4mL完全培养基； ⑥离心完成后弃去上清，用1mL完全培养基重悬细胞后，转入T25细胞培养中，混匀后转入CO2培养箱中培养静置。 注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。 （2）细胞传代 ①当细胞汇合度达到85%以上时，可进行传代； ②在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基； ③向培养瓶内加入3mL无菌的1×PBS 后，水平放置培养瓶，使PBS能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃PBS； ④向瓶内加入消化液1mL（0.25%胰蛋白酶），浸润底面后放入37℃ CO2培养箱中孵育3~5min； ⑤孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2mL含10%FBS的完全培养基中，将悬液吸入15mL离心管； 注意：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化： a. 准备一个无菌的15mL离心管，加入2mL含10%FBS的完全培养基； b.将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）； c.向之前消化的培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱落后加入2mL含10%FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。 ⑥1000rpm离心5min； ⑦准备两个新的T25培养瓶，各加入4mL完全培养基； ⑧离心完成后，弃上清，用2mL完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个T25培养瓶，每个培养瓶各1mL； ⑨水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。 （3）细胞冻存 ①~⑥请参照传代步骤； ⑦离完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入1.8mL冻存管中； ⑧将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温； ⑨第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。记录冻存管位置以便下次拿取。 注意：细胞冻存建议每瓶T25冻一支 七、注意事项 1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。 2、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。 3、细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含5-Fu的完全培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含5-Fu的完全培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加5-Fu。 4、若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低5-Fu的浓度，或使用不含5-Fu的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的5-Fu浓度。